凝胶层析介质的应用

宣布时间：2020-04-27

1. 凝胶层析的疏散方法

凝胶层析按其疏散方法，主要可分为组族疏散和分级疏散两大类型。

1.1 组族疏散：

组族疏散是将样品中的各组分分成巨细差别的两类分子，然后从低分子量物质中疏散出高分子量的物质，或者从高分子量物质中除去低分子量物质的一种疏散要领。在这种情形下，高分子量的物质完全被凝胶层析介质所排阻，不可扩散进入凝胶颗粒的内部，而随洗脱液流出层析床；小分子量物质则可以扩散进入凝胶颗粒内，洗脱体积险些相当于床体积。这种被疏散物质之间在分派系数上有极为显着的差别，称为组疏散、组别疏散或组族疏散。

组族疏散常用于生物产品的制备工艺中，如脱盐，即小分子盐与生物大分子的疏散，或在生物制品的最后阶段脱除低分子物质的精制工序等。组族疏散，只能将样品抵达粗疏散的目的，只有分子量相差悬殊的物质才华得以疏散，分子量相差越大，疏散效果越好。这种疏散要领的应用规模较量普遍，如在电泳和离子交流层析前事情液的脱盐、样品中缓冲液的替换、卵白质的脱盐、核酸制备中酚及无机盐等小分子的去除等。由于这种操作具有利便易行、装备简朴、卵白质接纳率高且样品稀释度低等优点，恒久在制备疏散中普遍应用。现在凝胶层析卵白质脱盐工艺，险些完全替换了透析法。脱盐工艺中凝胶层析介质的体积通常为样品体积的4~5倍，流速可达200cm/h左右。

1.2 分级疏散：

分级疏散是将分子巨细相近的物质脱离，其区分率要比组族疏散高，但有时洗脱曲线之间会爆发洗脱峰的重叠。分级疏散常用于物质的剖析，如分子量的测定，生物制品在精制时也接纳分级疏散，即为获取高活性部分的生物制品，获得纯品的精制历程。这种要领要使物质完全疏散是较量难题的，受到多种因素的影响。选择适当的疏散介质尤为主要，必需接纳孔径适当、疏散规模与分子巨细相顺应的凝胶介质。在操作方面，样品的上样量较少，仅为床体积的5%~10%，因此这种疏散常用于经由浓缩后的样品。把疏散柱加长，可提高疏散效果，但会增添床的压力降，减低流速。

组族疏散和分级疏散二者不但在应用方面有区别，在操作方面也有所差别。组族疏散的上样量较大，疏散容量大，但区分率低；而分级疏散的上样量少，疏散容量小，但区分率高。可是，这二者之间并没有截然的区别。除脱盐及分级疏散外，凝胶层析还适用于变性卵白质的复性及中草药有用因素提取疏散等工艺，也可举行多肽、卵白质、核酸及其它大分子物质分子量的测定及缓冲液的置换。

2. 凝胶层析介质的选择

2.1 类型的选择：

在举行组族疏散时，由于被疏散物质的分子量差别较大，因此易于选择凝胶。通常选用孔径小、排阻极限小的凝胶。由于凝胶层析介质的孔隙小，盐等小分子可以扩散进入凝胶颗粒内部，而大分子不可扩散进入，沿液体的流动偏向从柱中流出，抵达疏散的目的。

关于分级疏散，凝胶的选择很是主要，由于被疏散物质的分子量靠近，要凭证被疏散物质的分子量及种种凝胶的选择性特征曲线举行选择。一样平常先选择排阻极限较低的凝胶，这类介质由于孔径小，珠体的刚性较强，流速可以有较大的选择规模，有利于操作，使被疏散物质的洗脱较快，且活性物质的活性接纳率较高。若是在水溶液中操作，则选择亲水性的介质；若是在疏水性的有机溶剂中举行疏散，则必需选用疏水性的介质。

2.2 型号的选择：

在组族疏散时，凝集介质的选择较量容易，由于要疏散的两类组分在分子量上又很大的差别，因而容易举行完全地区分。应选择分子量在排阻极限以上的凝胶介质，是大分子量的物质不扩散进入凝胶内部，在外水体积时洗脱，这样区带的扩散和稀释水平最小，并能镌汰目的产品留在柱上的时间。脱盐工艺中常选用中等粒径的葡聚糖凝胶。相对分子质量低至5000的目的产品组分需要脱盐时，都可以选用它。这类凝胶介质具有较好的刚性、优良的通透性及较好的流速。

关于分级疏散而言，选择凝胶介质是一项主要的事情，由于需要疏散的物质是一系列分子量靠近的因素。选择时需要思量被疏散物质的分子量与凝胶介质的选择性曲线，即必需思量凝胶介质的疏散规模，若是凝胶介质选择不当，会使几种被疏散的物质险些同时从柱中流出，或可以同时在凝胶介质的孔中扩散，而获得的疏散谱图的洗脱峰都在外水峰中，或洗脱峰重叠，达不到疏散的目的。

若是在疏散中需要使用解离剂或洗涤剂时，凝胶介质的选择更应注重，要思量到它们对被疏散分子的构型所爆发的影响。由于用一些洗涤剂作为助溶剂对一些水溶性较低的膜卵白组分尤为合适，但对卵白质的构型有一定的影响，因此要选用孔径更大一些的凝胶介质较为合适。

由于种种凝胶介质的分类规模有时会部分重叠，对一些目的产品可选用的疏散介质也可能不止一种。这时通�？裳≡衽抛杓藿系偷哪航橹�，以使目的产品洗脱较快，尚有可能提高目的产品的活性接纳。别的，关于化学结构相同的凝胶介质，低排阻极限者往往有更佳的刚性，应用时可在较大的规模内选择流速，有利于生产效率的提高。

2.3 粒径的选择：

介质的粒径要凭证详细的实验情形而选择，尤其要凭证分类工具及要求抵达的目的而选择。粒径较小的疏散介质，颗粒在柱内易于漫衍匀称，形成的层析带扩散较小，区分率高，但流速较慢，主要用于区分率要求较高的分级疏散，适用于剖析层析、小柱操作、少量样品的精制及分子量的测定等。粒径较大的疏散介质，柱的通透性好，流速较快，相宜于处置惩罚大宗的事情液，如脱盐或分子量较大的物质之间的疏散，因而在规模生产中，多选用粒径较大的介质。但无论选择哪种类型的分类，都要求介质具有较窄的粒径漫衍，由于粒径漫衍越匀称，柱的区分率就越高，越易获得理想的疏散效果。

3. 凝胶层析柱的选择

3.1 柱结构的选择：

为了获得最佳的凝胶层析效果，应注重柱体装备的选用。层析柱是凝胶层析手艺中的主要部件，一样平常用玻璃管或有机玻璃管。在柱的下部应有孔径漫衍匀称的筛板，以利于流动相匀称地流出，避免柱内液体的偏流。在层析柱的滤板下，死体积应只管地小，若是支持滤板下的死体积大，则被疏散组分之间重新混淆的可能性就大，其效果将影响洗脱峰形，泛起拖尾征象，降低区分率。在准确疏散时，死体积不可凌驾床体积的千分之一。

在选用层析柱的材质及柱体时，还必需思量柱的耐压及耐溶剂性。柱体及各毗连部件都必需选用耐酸碱及耐有机溶剂的材质，以利于延伸层析柱的使用寿命，并可阻止对疏散物的污染。

3.2 柱内径的选择：

虽然层析柱直径的巨细不影响疏散度，但也要选用内径合适的柱体。较细的柱体有时会爆发管壁效应，而直径过大，则稀释将成为一项倒运的因素。柱体的直径应凭证疏散物的量来选用，在加样时应将样品匀称地漫衍于凝胶层析柱的床面上。制备用的凝胶层析柱，直径一样平常大于2cm，样品量较大时，可加大柱的直径。柱的直径加大后，洗脱液的体积将增大，样品的稀释度也将加大。

3.3 柱长度的选择：

凝胶层析中两个被疏散区带的疏散度取决于柱的高度，为疏散差别的组分，层析柱必需有合适的高度，区分率与柱体长度的平方根而成正比。因此相宜选用较长的柱体，尤其是分级疏散，以便于获得最佳的区分率。但关于某些基质较软的凝胶介质，若床柱过高，珠体受挤压会爆发变形，影响流速，以是一样平常应不凌驾1米。通常在举行组族疏散时，层析柱的长度大多在2~30cm之间，在举行分级疏散时，层析柱的长度需要100cm左右。层析柱的直径一样平常在1~5cm之间，小于1cm易爆发管壁效应，大于5cm则稀释征象严重。层析柱的长度与直径的比值一样平常宜在7~10之间，但对移动慢的物质，宜在30~40之间。关于疏散精度要求较高的工艺，也可接纳层析柱串联的要领，可以提高层析柱的区分率。

选择层析柱的一样平常原则是，柱的长度取决于工艺所要求的区分率，而柱的内径则取决于被疏散样品的量。在举行脱盐时，将所需体积的凝胶介质充装在短而粗的柱体内，是最佳的脱盐系统，这样可以取得较大的体积流速，提高脱盐的速率，镌汰对样品的稀释。而不宜选用长而细的柱体。

4. 凝胶层析操作中应注重的事项

4.1 凝胶层析介质的溶胀、装柱：

商品凝胶层析介质有的为干燥颗粒，使用前先举行水合膨胀，也可直接在洗脱液中举行溶胀。溶胀必需彻底，不然影响层析的均一性，甚至会有层析柱胀裂的危险。将凝胶介质颗粒直接放入水或洗脱液中，搅拌匀称，在室温下经由10小时左右即可获得较充分的溶胀。为了加速溶胀，也可举行加热，即在滚水浴中将湿的凝胶浆逐渐升温靠近欢喜，这样可大大加速溶胀的速率，约1~2小时即可抵达平衡。加热溶胀不但可以节约时间，还可消毒，除去凝胶介质中的污染物和扫除凝胶内的气泡。

凝胶层析介质充分溶胀后即可举行装柱。层析柱装置时要包管笔直，一样平常用泵将凝胶浆打入柱中。现在无论实验室或规模生产，都可以接纳装柱机举行装柱，这样可使柱内的介质漫衍匀称，并且装柱的速率也很快。若是是人工装柱，应将搅拌匀称的凝胶介质一次性倒入柱中，不可爆发分层征象。装柱后必需磨练柱中介质是否漫衍匀称，有无“纹路”或气泡，这样才华包管层析正常事情。在凝胶层析操作中，装柱是影响疏散效果的一个主要办法，为确保装柱效果，在装柱后可用1%的丙酮举行柱效测定，测定其理论塔板数。

4.2 柱的重复使用及生涯：

凝胶层析介质不会与被疏散物质爆发任何作用，因而在层析疏散后，只要稍加平衡就能举行下一周期的事情，这是凝胶层析介质的优点之一。因此凝胶层析介质在装柱后可以重复使用，不必特殊处置惩罚，而不影响疏散效果。琼脂糖系列的介质，一样平常是以湿态出售，并生涯在乙醇溶液中，因此在使用前应先用大宗的纯水洗去乙醇后再举行疏散工序。

在现实操作中，常有一些杂质污染凝胶介质或层析床的外貌，因此必需举行适当的处置惩罚，扫除这些“污染物”。应凭证污染的情形来决议处置惩罚的时间。一样平常情形下，稍微污染可以忽略，继续使用。当层析介质颜色爆发显着转变，甚至层析柱外貌泛起沉淀物，使外貌有显着板结时，则必需举行处置惩罚。除对样品举行预处置惩罚外，对层析柱也要举行净化处置惩罚。若是沉淀物与温度有关，可以用温水或适当的缓冲液举行洗涤，使沉淀消融、去除。若是难以消融，就必需将严重污染的表层介质挖掉，并添加新的层析介质。被污染的层析柱，可用0.2mol/L的NaOH和0.5mol/L的NaCl混淆溶液举行处置惩罚。这种要领，通�？上吹粢恍┪廴疚�。

若是污染严重，或层析柱经由若干次使用后，泛起介质的色泽改变，流速降低，外貌有污染物等情形时，必需接纳适当的要领举行处置惩罚，恢复其原来的性子和功效，这就是所谓的再生。关于多糖类的介质，可接纳温热的0.5mol/L NaOH和0.5mol/L NaCl混淆溶液缓慢通过层析柱，甚至可以浸泡一段时间，以扫除污染物，恢复层析柱的功效。

经常使用的层析柱以湿态生涯为好，只要在其中加入合适的防腐剂就可以避免几个月甚至一年，并不需要将介质干燥。特殊是琼脂糖介质，不但干燥操作繁杂，并且干燥后不易溶胀，因此一样平常都以湿态生涯。为了避免凝胶层析介质中滋生细菌，可将其生涯在20%的乙醇溶液中，或碱性溶液中。尤其是乙醇溶液浸泡，已成为现在通用的生涯要领。

4.3 对疏散样品的要求：

待疏散的样品必需无沉淀，且粘度不可太大，不然将影响疏散的效果。因此在举行层析之前，样品应举行预处置惩罚，除去其中的不溶性杂质，若能经由超滤等方法除去其中的胶体物质，不但可提高疏散效果，还利于延伸层析柱的使用寿命。

凭证疏散模式的差别，上样量略有差别，剖析性疏散及分级疏散都需要最大的区分率，与柱长相比，要求起始区带的宽度应很是狭窄。此时样品体积最好是柱体积的1%~5%。纵然再减小样品的上样量，一样平常也不可再提高区分率。关于组族疏散及某些分级疏散的实验中，峰的疏散优异，通过实验设计可以增添样品量，一样平常样品液量可达凝胶层析床体积的10%。在卵白质溶液除盐时，有时样品量也可高达凝胶层析床体积的20%~30%。上样量相宜，洗脱出的峰形才华较好，才华提高区分率。在规模生产中，为了提高生产效率，在能包管产品纯度的情形下，可只管加大样品的用量。

样品的粘度也是影响上样量和层析柱疏散效果的因素之一。粘度往往限制了所能接纳的最高浓度用量。样品浓度过高，使区带不稳固，流速也不规则，这样会使峰带严重扩宽和扭曲，影响疏散效果和上样量。此时应使用适当的缓冲液降低样品的粘度。

凝胶层析常作为下游的最终细腻纯化办法，通常与其它的工艺或其它的柱层析团结使用，例如肽、多糖、酶、重组卵白、抗体及大卵白等，样品已经由起源纯化、浓缩，选用适当的上样量，可以获得知足的疏散效果。

4.4 洗脱剂的选用：

在凝胶层析中，洗脱剂往往不直接影响区分率。关于完全不带电荷的物质，可用蒸馏水举行洗脱，带电荷物质的凝胶层析，可用适合的缓冲液举行洗脱，以控制pH值。关于多糖类的疏散介质，缓冲液的离子强度至少应为0.02mol/L。关于聚丙烯酰胺类的凝胶介质，离子强度为0.05mol/L。使用一定离子浓度的缓冲液，其目的是避免被疏散物质与凝胶介质骨架间的离子相互作用。有时在凝胶介质的分级疏散中，为阻止生物大分子与凝胶介质爆发非特异性吸附，甚至可在缓冲液中加入0.1~0.2mol/L的NaCl。

5. 流速的选择：

一样平常情形下，增添流速往往会使区分率下降，在使用长柱和低流速时，可以取得最大的区分率，使用短柱和高流速时可以获得快速的疏散。由此可见，优异的区分率和疏散时间是相互矛盾的。由于疏散的物质差别，柱的结构差别，必需凭证所要求的区分率举行实验，确定最佳的流速以获得知足的疏散效果。

综上所述，凝胶层析工艺参数对疏散纯化的效果有显着的影响，不但凝胶层析介质种类的选择有主要影响，其它各工艺参数，如柱的高径比、流速、介质的床高等因素都影响疏散效果。而参数简直立，要凭证待疏散的物质及所要求的纯度，通过实验而确定。

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